從克隆的但是表型各異的MC3T3-E1細胞系中分離出一系列亞克隆。從含抗壞血酸培養(yǎng)基生長的成骨細胞中選擇高或低成骨細胞分化、礦化的亞克隆。MC3T3亞克隆4（ATCCCRL-2593）和MC3T3亞克隆14（ATCCCRL-2594）在抗壞血酸和3到4mM無機磷酸鹽中生長表現(xiàn)出高水平的成骨細胞分化。它們10天后形成一個礦化良好的細胞外基質（ECM）。

　　MC3T3亞克隆24（ATCCCRL-2595)和MC3T3亞克隆30(ATCCCRL-2596)在抗壞血酸中生長表現(xiàn)出很差的成骨細胞分化。不形成ECM，可以作為亞克隆4和14的陰性對照。礦化的亞克隆選擇的表達作為成骨細胞標記的mRNA，及唾液酸糖蛋白(BSP)，骨鈣素(OCN)，和甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關蛋白受體的mRNA。

　　高或者低的分化潛能的亞克隆在培養(yǎng)中生產(chǎn)出相似數(shù)量的膠原質，表達可比較的基本水平的mRNA編碼Osf2/Cbfa1，一種成骨細胞相關轉錄因子。植入免疫缺陷小鼠以后，高分化性的亞克隆形成與骨類似的形成小骨的編織骨，低分化細胞只是產(chǎn)生纖維組織。這些細胞系是研究體外成骨細胞分化的好模型，尤其是ECM信號。它們和原代培養(yǎng)顱頂成骨細胞的行為類似。

　　1、小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

　　2、4min1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。

　　3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。